Bu küçük boyutlarda kayma gerilmesi $ \ tau $ genellikle dyne / cm2 veya N / m2 = Pa cinsinden ölçülür. Aralarındaki denklemler: $ 1dyn / cm ^ 2 = 10 ^ {- 5} N / cm ^ 2 = 0.1N / m ^ 2 = 0.1Pa $.
Pipetleme zigotlara ne tür zararlar verebilir?
Taramalı elektron mikroskobu kullanarak, üzerinde açık delikler bulduk. parçalanmış yumurtaların yüzeyi, mikroenjeksiyondan sonra plazma zarının yeniden kapanamadığını gösterir. Bölünmemiş yumurtalarda delik görülmedi, ancak çoğunda iyileşmiş delikleri düşündüren zar değişiklikleri vardı.
1.2 dyn / cm2'lik küçük bir kesme gerilimi bile zigotları pipetleyerek apoptozu indükler. Dolayısıyla, zigotların kritik kayma gerilmesi seviyeleri 1,2 din / cm2'dir ve pipetleme 1,2 din / cm2'den daha büyük kuvvetler içerir.
1,2 din / cm2'de kesme gerilimi, stresle aktive olan protein kinaz / jun kinazı indükler embriyolarda apoptozdan önce gelen ve buna neden olan fosforilasyon (Xie ve diğerleri, 2006b, Biol Reprod). Embriyoların pipetlenmesi, in vitro fertilizasyondan embriyoların toplanmasına kadar, gen ekspresyonunu mikrodizilerle analiz etmeden önce birçok protokol için gereklidir. Pipetlemenin fosforile edilmiş MAPK8 / 9'u (daha önce stresle aktive olan protein kinaz / jun kinaz / SAPK / JNK1, 2 olarak biliniyordu) yukarı regüle edip etmediğini belirlemeye çalıştık. MAPK8 / 9 aktivasyonunun bir belirteci olan fosforile MAPK8 / 9'un pipetleme ile doza bağlı bir şekilde yukarı regüle edildiğini bulduk.
Kritik kayma gerilmesi seviyesi, hücre türüne ve türüne bağlı olarak hayvan hücreleri tarafından 0,01 ile 1000 din / cm2 arasındadır. (Sanırım ortalama 50 dyn / cm2 civarında, ancak kritik kesme seviyelerinden ve en ölümcül kesme seviyelerinden bahseden makaleler arasında ayrım yapmak çok zor, bu nedenle aralık ve ortalama daha düşük olabilir.) Ölüm sabiti (1 / h ), kayma gerilimini artırarak üssel olarak artar.
Kayma geriliminin yapışık BHK hücreleri üzerindeki etkisinin ayrıntılı incelenmesi için bir aparat geliştirildi. 0,0 ile 2,5 N m 2 arasındaki kesme kuvvetleri incelenmiştir. Hücre canlılığı, hücre morfolojisi, hücre lizizi ve hücre boyutu üzerindeki etki belirlendi. Artan kesme kuvvetleri ve artan maruz kalma süresi, hücre morfolojisinde ve hücre ölümünde artan değişikliklere neden oldu. Bir "kritik kayma gerilmesi seviyesi" belirlendi.
Bir fare hibridomasına yönelik kesme gerilimi ile ilgili hasar, koaksiyel silindirli Searle viskozimetrede laminer ve türbülanslı koşullar altında Abu-Reesh ve Kargi tarafından incelendi. Hücreler, 0.5 ila 3.0 saat süreyle 5 ila 100 N / m2 kayma gerilmesi seviyelerine maruz bırakıldı. Belirli bir kesme gerilimi ve maruz kalma süresinde, türbülanslı kesme, geçmişte protozoa ve bitki hücreleri için de bildirildiği gibi, laminer kesmeden çok daha fazla zarar vericiydi. Türbülanslı koşullar altında, kesme gerilimi 5 N / m2'yi aştığında hasar meydana geldi. Hücrelerin solunum aktivitesi, hücre zarından daha önce hasar gördü, bu da stres sinyalinin hücrenin içine iletildiğini gösteriyor. Hücre hasarı, hem laminer hem de türbülanslı ortamlarda birinci dereceden kinetiği takip etti. 5 ila 30 N / m2 türbülanslı kayma gerilmesi seviyeleri için, ölüm oranı sabiti (kd) artan gerilim seviyesi ile üssel olarak artmıştır; kd değerleri 0,1 ile 1,0 1 / sa arasında değişiyordu.
Sürekli olarak 1-5 din / cm2 kayma proliferasyonuna maruz kalan alt konfluent endotel kültürleri, aşağıdakilere benzer bir hızda statik kültürlerinki ve aynı doygunluk yoğunluğuna ulaşır (– 1.0-1.5 × 105 hücre / cm2). 5-10 din / cm2'lik bir laminer kayma gerilimine maruz kaldıklarında, birleşik tek tabakalar, hücre şeklinde çokgenden elipsoide doğru zamana bağlı bir değişikliğe uğrar ve akışla tekdüze bir şekilde yönlendirilir. Birbirine karışan tek tabakadaki doğrusal "yaraların" rejenerasyonu, uygulanan kuvvetin yönünden etkileniyor gibi görünmektedir. Ön çalışmalar, sıvı endositoz, sitoskeletal montaj ve trombojenik olmayan yüzey özellikleri dahil olmak üzere belirli endotel hücre fonksiyonlarının da kayma stresine duyarlı olduğunu göstermektedir. Bu gözlemler, sıvı mekanik kuvvetlerin endotel hücre yapısını ve işlevini doğrudan etkileyebileceğini göstermektedir.
0.25 dyne / cm (2) üzerindeki kayma stresi, 20 saat sonra proksimal tübüler epitel hücrelerinde (LLC-PK (1) hücreler) değil, podositlerde dramatik kayıpla sonuçlandı.
Bir dizi dikkatli rotasyonel bir viskozimetrede kan hasarı konusunda çalışmalar yapılmıştır. Katı yüzey etkileşimi, merkezkaç kuvveti, hava arayüzü etkileşimi, kesilmiş ve kesilmemiş katmanların karıştırılması, hücre-hücre etkileşimi ve viskoz ısınmanın etkilerine özel önem verilmiştir. Sonuçlar, 1500 din / cm2'lik bir eşik kayma gerilimi olduğunu, bunun üstündeki kapsamlı hücre hasarının doğrudan kayma gerilimine bağlı olduğunu ve yukarıda listelenen çeşitli ikincil etkilerin ihmal edilebilir olduğunu göstermektedir.
Bazı dinoflagellatların (mikroalg) kayma gerilmesi eşiği, eritrositlerinkinden (0.029 N / m2) bile daha düşüktür. Örneğin, yalnızca 0,0044 N / m2'lik (2,2 1 / s'lik bir kesme hızına eşdeğer) sürekli bir laminer kesme gerilmesi seviyesinin dinoflagellat Gonyaulax polyedra için ölümcül olduğu kanıtlanmıştır.
Diğer hücre tipleri, hayvan hücreleri kadar hassas gerekli değildir ve apoptozla (yaklaşık 10 dyn / cm2) kesilmek üzere reaksiyona girmeleri gerekmez. stres, bu yüzden onları yok etmek için nekrotik (yaklaşık 5000 dyn / cm2) kuvvetler kullanmanız gerekir:
hücre tipi boyutu kayma hassasiyeti mikrobik hücreler 1-10μm düşük mikrobiyal peletler / kümeler 1 cm'ye kadar orta bitki hücreleri 100μm orta / yüksek bitki hücresi, mikro taşıyıcılarda 1-2 cm yüksekliğe kadar yüksek hayvan hücreleri 20μm yüksek hayvan hücreleri toplar 80-200μm çok yüksek mantarlı hücreler 2-10μm orta / yüksek
Sonuçlar, Çin Hamster Yumurtalıklarının ve İnsan Embriyonik Böbrek hücrelerinin, salınımlı, genişlemeli akışta düşük seviyelerde hidrodinamik strese (yaklaşık 2.0 Pa) maruz kaldıklarında apoptotik yola gireceğini göstermektedir. Buna karşılık, hücreler maruz kaldığında nekrotik ölüm hüküm sürer.
basit kayma akışında 1.0 Pa civarında veya genişleme akışında 500 Pa civarında hidrodinamik gerilmeler.
Kayma hassasiyeti yalnızca hücre tipine ve türüne göre belirlenmez, ilgili başka birçok faktör vardır:
- hücre türü ve tür
- mevcut olduğunda hücre duvarının bileşimi ve kalınlığı
- hücrenin boyutu ve morfolojisi
- ister türbülanslı ister laminer veya arayüzlerle ilişkili olsun, kayma geriliminin yoğunluğu ve yapısı (ör. balonun yükselmesi ve kopması sırasında)
- büyüme geçmişi, hem kısa vadeli (ör. açlık) hem de uzun vadeli adaptasyon
- büyüme ortamı (eser elementler, vitaminler, karbon ve nitrojen kaynakları)
- büyüme oranı
- büyüme aşaması
- varsa kesme koruyucu ajanların türü ve konsantrasyonu
Hücreler kesilmeye karşı çok hassas olabilir türbülanslı akışın neden olduğu stres
Laminer akış viskometrisi ölçümleri temelinde, Morindata citrifolia hücreleri için 80-200 N / m2'lik kritik bir kesme gerilimi seviyesi önerilmiştir.
... Daucus carota için 50 N / m2 kayma gerilimi seviyesi hücre hasarıyla ilişkilendirilmiştir. Başka bir çalışmada, laminer akışlı Couette viskozimetresindeki havuç hücreleri, 0.5-100 N / m2 kayma gerilimi aralığında büyüme ve bölünme yeteneğini kaybetti. Hücre içi enzim aktivitesi, 3000N / m2'nin üzerindeki kayma gerilmesi seviyelerinde bozulmuş, ancak 10.000 N / m2'lik bir kayma gerilmesi seviyesi uzun bir perioud (> 1 saat) uygulanana kadar önemli bir parçalanma gerçekleşmemiştir.
Aksine laminer akıştaki davranışa göre, hücreler türbülanslı çark çalkalamasına oldukça duyarlıydı. Pervane ucu hızları ~ 1,1 m / s, hücrelerin önemli bir bölümünü 40 dakika içinde parçaladı.
Kabarcığın ara yüzüne hücre yapışması ve ilgili güçlü kuvvetler (karıştırılan biyoreaktörler tarafından> 1000 din / cm2) nedeniyle kabarcık hasarı ciddidir (tek bir 3,5 mm boyutunda balonla 1000 hücre). Yapışma ve dolayısıyla hasar yüzey aktif maddelerle azaltılabilir.
Hücrelerin bir yırtılma balonuna bağlandığı veya çok yakın olduğu durumlarda hidrodinamik kuvvetlerin rüptür ile ilişkili hücreler hücreleri öldürmek için yeterlidir.
Tüm deneyler Spodoptera frugiperda (SF-9) böcek hücreleri ile, Pluronic F-68 ile ve olmadan TNM-FH ve SFML ortamında gerçekleştirildi. Deneyler, TNM-FH ortamında tek, 3.5 mm'lik kabarcık kopması başına yaklaşık 1050 hücrenin öldüğünü ve yukarı doğru jette yaklaşık olarak aynı sayıda ölü hücrenin bulunduğunu göstermektedir. Bu yukarı doğru jetteki hücre konsantrasyonunun Pluronic F-68 içermeyen TNM-FH ortamındaki hücre süspansiyonundan iki kat daha yüksek olduğu da gözlendi. Bu daha yüksek konsantrasyonun, hücrelerin kabarcık arayüzüne yapışmasının bir sonucu olduğuna inanılmaktadır. Bu hücreler, kabarcık kırılma işlemi sırasında yukarı doğru jete doğru süpürülür. Son olarak, bu emilen hücreleri içeren balonun etrafındaki ince bir tabakanın, diğer araştırmacılar tarafından sunulan "varsayımsal öldürme hacmi" olduğu öne sürülmüştür.
Bir hibridoma hattı için, havasız akışta laminer kayma gerilimine (208 N / m2) maruz kalmanın bir koni ve plaka viskozimetre, hücre sayısında ve 20 dakika içinde canlılıkta önemli bir kayba yol açtı. Sabit 180 s maruziyette, kesme gerilimini 100-350 N / m2'nin üzerine çıkarır
350 N / m2 stres seviyesinde hücrelerin>% 90'ının yok edilmesiyle doğrusal olarak geliştirilmiş hücre bozulması. Bir biyoreaktör yüzeyindeki kabarcık kopmasıyla ilişkili kayma gerilmesi seviyeleri 100-300 N / m2'nin üzerinde değişebilir. Bu değerler, havalandırılmamış laminer akış deneylerinde hibridomalara zarar veren kayma hızlarıyla oldukça tutarlıdır.
Daha küçük delikli pipetler daha fazla hasara neden olur.
Ayrıca enjeksiyon pipetlerinin boyutu ve zigot çapına göre konikliği, olası toksisite gibi gen transfer prosedürünün hayatta kalmasını etkileyebilecek yönlerini de inceledik. enjeksiyon ortamı, enjeksiyonun zamanlaması ve pipetin hemen veya gecikmeli çekilmesi. Hücre canlılığını önemli ölçüde etkileyen tek faktör, pipet boyutu ve incelmesi ve ilk bölünmeye göre enjeksiyonun zamanlamasıydı. Bu, zigot canlılığının enjeksiyon pipetinin ürettiği deliğin boyutuyla ters orantılı olduğunu ve döllenmiş yumurtanın kendisini bölünmeye hazırlandıkça zara verilen hasarın daha az başarılı bir şekilde tamir edildiğini göstermektedir.
Pipetleme ile kesme gerilimi seviyesi hakkında bir şey bulmak zor. Kesinlikle 1 dyn / cm2'den fazla olabilir. Kısa bir süresi vardır (en fazla birkaç saniye). Aşağıdaki faktörlerin pipetleme yoluyla kayma gerilimi seviyelerini etkileyebileceğini düşünüyorum:
- pipet tipi
- akış hızı (daha hızlı akış daha büyük olasılıkla türbülanslı olabilir)
- kabarcık oluşumu
Muhtemelen daha fazla faktör söz konusudur, ancak ben bir pipetleme uzmanı değilim. ;-) Diğerleriyle aynı fikirdeyim, kesinlikle kişisel becerilere bağlı. bir amatör pipetleme yoluyla büyük baloncuklar oluşturabilir, bu da birçok hücreyi oluşum ve bozulma yoluyla öldürebilir ...
Artem'e katılıyorum, özellikle sonuç sizin için önemliyse, bunun yapılması gereken bir deney. Pipet hasarı hakkında bir model oluşturmak için ihtiyacınız olan şey, pipetleme ile kesme gerilimi seviyeleri ve hücrelerin kritik kesme gerilimi seviyeleridir. Pipetlerinizdeki kayma gerilimi seviyelerini ölçebileceğiniz ve bildiğim kadarıyla pipetleme için bir akış modelinin bulunmadığı, bu nedenle bir tez veya diploma çalışması için iyi bir konu olabileceği bir tasarım ve deney yapmanın zor olduğunu düşünüyorum.